O jogo se passa na Europa ocupada pelos nazistas, em 1943. O protagonista B.J. Blazkowicz, soldado do exército dos Estados Unidos, e outro agente (batizado "Agent One" no Xbox e Mac) foram enviados para investigar um projeto de Heinrich Himmler, a Divisão Paranormal da SS. Porém os dois são capturados e presos no castelo Wolfenstein (baseado no castelo real de Wewelsburg). Agent One é morto durante um interrogatório por um torturador, mas Blazkowicz consegue matar o soldado guardando sua cela e prepara sua fuga. Após fugir, o jogador deve continuar investigando a Divisão Paranormal, que envolve experimentos com biotecnologia, ressureição de cadáveres e armas secretas. Apenas as duas primeiras missões tem ligação direta com Wolf 3D (envolvendo a fuga do castelo e soldados zumbis). Wolfenstein 3D fora banido na Alemanha, e para evitar o mesmo com Return to Castle Wolfenstein, a id fez adaptações ao lançar no país: não há citações explícitas ao Terceiro Reich, a suástica é substituída por duas águias formando um "W", e se combate uma facção chamada "Lobos", comandadas por Heinrich Höller.